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草胡椒属植物抗肿瘤作用及其作用机理研究

发布时间:2019-12-10 14:28源自:未知作者:admin阅读()

  天然产物是抗肿瘤药物研发的重要源泉,目前40%以上的临床用药来源于天然产物及其衍生物,其中包括紫杉醇、长春碱、鬼臼毒素和喜树碱等。草胡椒属植物在云南、贵州等地民间被用作传统抗肿瘤药物,但对其抗肿瘤的相关分子机制介绍并不多见。本论文以三种草胡椒属植物为研究对象进行抗肿瘤活性的初步分析,并对抗肿瘤活性较强的豆瓣绿进行了机制研究,初步阐明了豆瓣绿及其化学成分抑制肿瘤细胞增殖和诱导细胞凋亡的分子机制。同时对豆瓣绿乙醇提取物的不同萃取部位及单体化合物进行了抗肿瘤活性筛选确定。(1)运用MTT法评价了石蝉草、豆瓣绿、草胡椒的乙醇提取物对人单核细胞白血病U937细胞增殖的影响。结果表明这三种植物均可以显著抑制U937细胞增殖,且豆瓣绿抑制细胞增殖的活性最强。然后我们考察了豆瓣绿乙醇提取物、乙酸乙酯萃取部位和萃余水层抑制U937细胞增殖的活性,结果发现其乙酸乙酯萃取部位具有最强的活性,推测其可能是豆瓣绿抗肿瘤的有效部位。(2)探讨了豆瓣绿提取物对人单核细胞白血病U937细胞凋亡的分子机制。采用Hoechst 33342荧光染色观察发现豆瓣绿乙醇提取物和乙酸乙酯萃取部位均可诱导U937细胞凋亡。采用Annexin V-FITC和PI染色,发现其乙酸乙酯萃取部位呈量效和时效关系诱导细胞凋亡。通过PI染色,发现豆瓣绿的乙醇提取物和乙酸乙酯萃取部位还可使U937细胞细胞周期发生阻滞,表现为G2/M期细胞比例明显减少、S期增多、G1期减少。采用Westren Blot技术,发现豆瓣绿乙酸乙酯萃取部位引起U937细胞细胞周期相关蛋白:细胞周期蛋白D1(CCND1)、细胞周期蛋白B1(CCNB1)和周期蛋白依赖性蛋白激酶1(CDK1)表达显著减少。进一步的研究表明,豆瓣绿的乙酸乙酯萃取部位可激活半胱天冬氨酸蛋白酶-8(Caspase-8),促凋亡蛋白Bid裂解,下游的效应Caspase半胱天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)被激活;另一方面,乙酸乙酯萃取部位还可引起活性氧(ROS)升高,线粒体膜电位(MMP)下降,Bax表达升高,半胱天冬氨酸蛋白酶-9(Caspase-9)活化和Caspase-3激活。由此得出豆瓣绿乙酸乙酯萃取部位可通过Caspase依赖的外源途径和线粒体调节的内源途径诱导细胞凋亡。(3)筛选了豆瓣绿乙酸乙酯部位抗肿瘤的活性成分。为探究豆瓣绿乙醇提取物抑制U937细胞增殖的主要活性部位,对豆瓣绿乙醇提取物的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等有机溶剂萃取部位和萃余水层的抗肿瘤活性进行了检测。结果表明,豆瓣绿的石油醚部位和乙酸乙酯部位具有较强的抑制U937细胞增殖的活性。选用豆瓣绿乙酸乙酯部位,通过硅胶柱色谱法,用氯仿和甲醇进行梯度洗脱,得到7个不同组分1-7。检测各组分细胞毒活性发现:组分1、2和7均具有抑制U937细胞增殖的活性,且组分1的活性最强。我们从豆瓣绿乙酸乙酯部位中分离纯化得到3个单体化合物。随后我们考察了三个化合物对人单核细胞白血病细胞U937,黑色素瘤细胞A375,人皮肤鳞状表皮癌细胞A431和膀胱癌细胞T24细胞增殖的影响。结果表明:化合物1(Peperobtusin A)的细胞毒活性最好,对多种肿瘤细胞均具有显著抑制增殖的活性。化合物2和3对几种肿瘤细胞敏感性较差。以上结果说明组分1是豆瓣绿乙酸乙酯部位抗U937细胞增殖的主要活性成分,而Peperobtusin A可能是其发挥细胞毒作用的主要活性成分之一。(4)研究了Peperobtusin A对人单核细胞白血病U937细胞凋亡的分子机制。运用Annexin V-FITC染色,对Peperobtusin A引起A431和U937细胞凋亡进行检测,发现相同作用浓度下Peperobtusin A引起U937细胞凋亡更明显。研究还发现Peperobtusin A使U937细胞细胞周期发生S期阻滞。进一步研究表明,Peperobtusin A能够引起U937细胞活性氧升高,线粒体膜电位降低,Caspase-8、Bid、Caspase-9和Caspase-3蛋白裂解增加,Bax表达升高。同时,发现用Caspase抑制剂Z-VAD-FMK预处理后可显著降低Peperobtusin A引起的U937细胞凋亡率,结合抑制剂处理后Western Blot结果,推断Peperobtusin A通过Caspase依赖性凋亡途径诱导细胞凋亡。有研究表明有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路与细胞凋亡密切相关。对P38MAPK信号途径中的P38和P-P38进行研究,分析药物单独处理和Z-VAD-FMK、B203580分别预处理后结果,表明P38MAPK-Caspase-9参与Peperobtusin A诱导的细胞凋亡。

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